拉曼光谱技术在生物制药与细胞合成监控中的应用

摘要：拉曼光谱技术以其非破坏性、高灵敏度、快速分析等优势，已广泛应用于生物制药与细胞合成监控领域。通过对蛋白质、核酸、小分子等物质的拉曼特征峰进行实时监测与定量建模，可有效提升抗体浓度预测、药物定量检测、细胞代谢追踪等过程的精度与效率。结合多种算法（如PLS、MCR-ALS、PCA等）和先进仪器配置，如在线拉曼光谱仪与浸入式探头，该技术为制药过程质量控制、早期疾病筛查及发酵监控提供了高效可靠的解决方案。

一、研究背景

拉曼光谱是一种基于分子振动模式的分析技术，能够提供有关分子结构和化学组成的信息，在生物制药领域中具有广泛的应用。

在生物制药领域，对生产过程的精确监控是确保产品质量和安全性的关键。随着科技的发展，拉曼光谱技术以其独特的优势，正逐渐成为生物制药与细胞合成监控的重要工具。

生物制药领域对产品质量和生产效率的要求不断提高，传统的细胞合成监控方法由于其破坏性、耗时和灵敏度不足等问题，已无法满足当前的需求。拉曼光谱技术以其非破坏性、快速、高灵敏度的特点，为生物制药的研究和质量控制提供了一种全新的解决方案。

二、实验依据

2.1 利用拉曼光谱实时预测亚类独立的定量单抗的可能性

Denizhan Yilmaz等人利用拉曼光谱技术成功实现了对单克隆抗体（mab）浓度的实时预测。通过使用三种不同的CHO细胞系生产mab，研究人员采用激光器为785nm的拉曼光谱仪连续采集光谱数据，选取900~1840cm⁻¹的光谱区域进行分析。通过二阶多项式导数和标准正态变量变换（SNV）预处理，消除了噪声和荧光信号的干扰，构建了一个定量模型，校验集与测试集结果如图1所示。

图1 校验集与测试集结果

该模型在预测不同单抗同型抗体浓度时表现出高准确性，平均预测误差仅为0.2g/L。这一成果不仅证明了拉曼光谱技术在生物制药领域中的潜力，而且为单克隆抗体生产过程的实时监控提供了一种高效、非破坏性的新方法。

2.2 双模态单抗体法

Johns Hopkins University的Zheng P等人开发了一种结合峰免疫分析和表面增强拉曼光谱（SERS）的双模态单抗体方法，用于精确检测小分子，如血清中的游离甲状腺素（T4）和睾酮。

该方法利用两种独立的信号转导机制，通过SERS技术放大特定拉曼峰，有效预测分析物浓度并减少信号伪影。实验建立了基于1075cm−1和1580cm−1峰值的游离T4浓度回归模型，展现了高预测准确性（r2分别为0.90和0.88）。此外，通过分析MBA在1580cm⁻¹处的峰值偏移，进一步建立了与游离T4浓度对数呈良好相关性的回归模型（r2为0.92），结果见图2。

图2 游离T4浓度回归模型检测结果

这项研究创新性地提出了一种基于SERS峰强度和位移的小分子检测方法，并结合3D打印技术，为生物传感领域提供了一种高通量、可扩展的检测策略。

2.3 基于谱聚类和SCRS的细胞生长检测方法

吉林大学李新立等人开发了一种基于谱聚类和单细胞拉曼光谱（SCRS）的方法，用于实时监测单细胞微生物的生长和代谢变化。该方法使用SG平滑、airPLS算法，通过共聚焦显微镜采集实验组样本大肠杆菌菌液和验证组样本枯草芽孢杆菌菌液在三个生长时期的样本，三个生长时期测量的光谱见图3。

图3 三个生长时期的测量光谱

实验使用t-SNE算法将高维的SCRS数据应用t-SNE投影到二维平面，对数据进行聚类，当簇为3时聚类效o，并将样本在三个生长时期进行了准确的聚类，聚类结果见图4。

图4 三个生长时期的聚类结果

实验同样在验证组枯草芽孢杆菌中进行了验证，得到了理想的聚类结果。

2.4 拉曼光谱技术对贝伐珠单抗溶液进行定量分析

在Michail Lykouras等人的研究中，他们利用拉曼光谱技术对贝伐珠单抗溶液进行定量分析，以提高生物制药领域中药物浓度测定的准确性。

通过采集干燥阿瓦斯丁®溶液和二水海藻糖的拉曼光谱并进行减法处理，研究者得到了与标准贝伐单抗光谱相似的减谱（生成的减谱见图5中的红线部分），从中识别出与特定氨基酸残基相关的特征峰值，实验结果见图5。

图5 实验结果

随后，通过对不同浓度样本的光谱测量和曲线校准，确立了在3.75–25.00 mg/mL范围内的高线性关系（R² > 0.99）。此外，研究还确定了测量区域，即咖啡环中间距离外部边缘25µm到125µm的区域，以实现精确的定量分析。

这项研究表明，拉曼光谱技术能够达到低于药物治疗所需贝伐珠单抗低浓度的检测限，为药物质量控制提供了一种有效的分析方法。

三、实验方案和配置

3.1 实验材料与仪器

• 本次实验使用的仪器是由如海光电研发的在线拉曼光谱仪、浸入式拉曼探头
• 电子天平、葡萄糖、生物发酵液

图6 拉曼光谱采集系统

3.2 光谱采集方法

拉曼光谱采集积分时间为120s，激光功率为500mw对不同葡萄糖浓度的生物发酵样本测量，共测得24条拉曼光谱实验采集图谱，见图7。

图7 采集拉曼光谱

3.3 光谱预处理

实验使用SG平滑、airPLS、Max-Min算法对原始采集光谱进行预处理，预处理结果见图8。

图8

四、实验结果

4.1 MCR-ALS光谱分解

实验使用MCR-ALS算法，将样本光谱中葡萄糖与发酵液拉曼特征分离，分离后结果见图12。其中a为葡萄糖的标准参考光谱，b为MCR-ALS算法分离的葡萄糖光谱，在拉曼位移为500cm-1、600cm-1、1100cm-1、1400cm-1附近多处，参考光谱与分离光谱有多处重叠的拉曼特征峰，可以被认为与葡萄糖分子结构相关。

图9 葡萄糖计算光谱与参考光谱

4.2 定量分析

实验对分离后光谱结合CARS降维算法、PLS建模算法实现，对生物发酵过程中葡萄糖浓度进行了定量分析，训练集R2=0.99289、RMSE=0.00036，测试集R2=0.98031、RMSE=0.00061建模结果见图10，实验测试集训练预测结果以及预测相对误差见表1。

图10 建模结果

表 1 预测集结果

五、结论

拉曼光谱技术在生物制药与细胞合成监控中的应用研究证明了其在实时监控和定量分析方面的有效性和准确性。通过精确的光谱测量和先进的数据处理算法，拉曼光谱技术能够为生物制药行业提供一种快速、高灵敏度的监控手段，有助于提高生产效率和产品质量。此外，拉曼光谱技术的非破坏性特点使其可广泛应用于细胞的合成监控中，能够在不干扰细胞生长的情况下进行实时监控。