表面增强拉曼光谱在化妆品美白功效评价中的应用

摘要：如海RMS拉曼光谱仪凭借高灵敏度和快速检测能力，为化妆品美白功效评价提供科学可靠的新手段。

一、研究背景

美白化妆品可以减少皮肤色素沉着，起到皮肤增白的效果。然而，随着市场竞争日益激烈，许多不法商家虚假宣传，导致市面上充斥着许多种劣质品。络氨酸酶活性（TYR）是化妆品美白功效评价的重要指标，其活性与黑色素形成密切相关。传统检测TYR的方法主要有电化学法、比色法和荧光法，但这些方法普遍存在耗时长、灵敏度低和易受干扰等问题。因此，开发一个能快速灵敏、准确可靠检测TYR的方法具有重要意义。本研究提出了一种基于细菌纤维素膜-金纳米棒（BCM-Au NRs）的柔性表面增强拉曼散射（SERS）传感器，并使用如海光电的便携式拉曼光谱仪（RMS1000）实现了TYR活性的实时监测。

二、研究内容

2.1 实验方法

图1为等离子体纳米柔性膜的制备以及络氨酸酶活性的检测示意图。TYR 氧化多巴胺（DA）成多巴醌（DQ），在黑色素生成过程中，DQ 迅速自发地朝着黑色素形成方向发展，进一步氧化形成 5，6-二羟基吲哚（DHI）和 5，6-二羟基吲哚-2-羧酸（DHICA）。借助便携式拉曼光谱仪，观察到在拉曼光谱中产生两个宽带，中心分别位于约 1400 cm-1 和 1600 cm-1 处，这与文献中报道的类似化合物的光谱位置一致，基于特征峰 SERS 强度的变化直接反应TYR 活性的变化。

图 1等离子体纳米柔性膜的制备以及络氨酸酶活性的检测示意图

2.2 Au NRs的表征

Au NRs 通过 UV-VIS 吸收光谱以及 TEM 进行表征。通过紫外光见吸收光谱图观察到Au NRs 的各向异性形状产生了两种不同的LSPR模式，在520 nm处有弱的紫外吸收峰，在841 nm处则显现强的紫外吸收峰（图2 A），两者分别代表了Au NRs的宽度和长度。图2 B显示了Au NRs相应TEM 图像，表明 Au NRs的成功合成。

图 2  Au NRs的紫外可见吸收光谱（A）和Au NRs的TEM图像（B）

2.3 BCM-Au NRs柔性SERS基底的表征及性能优化

图3A-E分别为0.70、1.4、2.1、2.8、3.5 nM浓度的Au NRs负载到BCM上的形貌图。图3F为柔性膜基底中Au NRs的密度与Au NRs分散体浓度的关系图，BCM上Au NRs的密度随Au NRs溶液浓度的增加而增加。将五种不同浓度的Au NRs制备出来的基底浸入R6G中，测量了R6G的SERS信号，如图3G所示。图3H为R6G在1509 cm-1处特征峰（芳香族C-C拉伸振动）的SERS 强度与Au NRs浓度的直方图。结果表明，当1.4nM浓度的Au NRs加载到BCM上时，BCM-Au NRs柔性膜的SERS性能好。

图 3 不同浓度的Au NRs制备而成的BCM-Au NRs柔性膜的SEM图像（A：0.7nM；B：1.4nM；C：2.1nM；D：2.8nM；E：3.5nM）；（F）BCM-Au NRs柔性膜中Au NRs的密度与Au NRs浓度的关系图；（G）BCM-Au NRs柔性膜上R6G的SERS光谱；（H）R6G在1509 cm-1处SERS特征峰信号强度直方图

2.4 BCM-Au NRs柔性基底的灵敏度分析

将负载Au NRs的纤维素膜剪切至3 mm×3 mm，分别浸泡在10-3 M ~ 10-9 M 的R6G 溶液中 2 h 后，干燥，用如海光电的RMS1000便携式拉曼光谱仪进行灵敏度检测。如图4所示，BCM-Au NRs柔性基底对R6G有较好的SERS信号响应，检测至10-9 M仍有 R6G 特征峰信号 产生。

图 4不同浓度的R6G在BCM-Au NRs柔性基底上的SERS光谱

2.5 BCM-Au NRs柔性基底均匀性评价

以R6G位于1509 cm-1 处的SERS特征峰强度作为成像条件，扫描20 μm × 20 μm区域内1509 cm-1特征峰的拉曼信号强度，通过二维图像中的颜色强度分布来表示信号的强弱和均匀性。如图5所示，BCM-Au NRs柔性基底的SERS信号的相对标准偏差（RSD）为12.66%，呈现出良好的均匀性。

图 5 R6G在1509 cm-1处特征峰的mapping图像

2.6 BCM-Au NRs柔性基底不同批次间可重复性分析

采集10-5 M R6G在不同批次制备的BCM-Au NRs柔性膜上的SERS光谱。结果如图6所示，在五个不同批次的BCM-Au NRs柔性SERS基底上R6G在1509 cm-1 处的SERS信号表现基本一致，说明BCM-Au NRs柔性基底具有良好的重现性。

图 6 R6G在不同批次的BCM-Au NRs柔性基底上的SERS信号强度直方图

2.7 BCM-Au NRs柔性基底的时间稳定性评价

图7表明BCM-Au NRs柔性膜在常温下储存30天后，其SERS光谱基本没有变化，从而证实了所制备的 BCM-Au NRs 柔性膜具有优异的时间稳定性，具有实际应用的潜力。

图 7 R6G在存放不同时间段后的BCM-Au NRs柔性基底上的SERS光谱

2.8 络氨酸酶活性的测定

将TYR和DA溶液混合，收集反应1~90min所获得的SERS光谱，如图8a所示，DA溶液在加入TYR后迅速发生氧化反应，在SERS光谱区域中显示了几个明显的宽带，通过对新的特征峰进行归位认证，生成的产物与黑色素的生成物基本一致，说明此方法检测TYR活性可行。此外，采集TYR与DA混合后的紫外可见吸收光谱，如图8b所示。图8c和图8d为检测到的TYR活性的标准曲线，在0.01U/mL~100U/mL浓度范围内，SERS强度与TYR对数浓度呈良好线性关系，线性方程为 Y=-420.77 X+1327.71，R2=0.9828，说明两者具有良好的线性关系。

图 8（A）TYR与DA反应不同时间的SERS光谱（a~i）分别为0，1，5，10，15，30，40，60，90min；（B）TYR与DA反应不同时间的紫外可见吸收光谱；（C）在0.01 U/mL~100 U/mL内，TYR与DA的氧化反应产物的SERS光谱；（D）1390 cm-1处的SERS信号强度与TYR浓度之间的线性关系

2.9 实际样品检测

以美白祛斑乳液作为实际样本，配置不同浓度的乳液（0.1g/mL、0.2g/mL、0.3g/mL、0.4g/mL、0.5g/mL），分别与100U/mL的TYR孵育15min后，加入1mM DA溶液，均匀后滴加在BCM-Au NRs柔性基底上。表1为美白祛斑乳液对络氨酸酶活性的影响，表明乳液中的美白功效成分对TYR活性的有效抑制。

表 1美白祛斑乳液对酪氨酸酶活性的影响

三、结论

利用如海光电RMS1000便携式拉曼光谱仪通过开发的BCM-Au NRs柔性SERS传感器，直接获取了TYR反应过程的信号变化。设计的SERS传感器对0.01U/mL~100U/mL浓度范围内的TYR活性具有优异的线性曲线，R2=0.9828。整个检测过程可以在1min内完成，可以快速、灵敏、准确的评价化妆品的美白功效，为当前的化妆品美白功效评价提供了额外的参考手段。

四、文献来源