| 发布日期：2022-06-02 |
前言：
荧光是一种光致发光现象，涉及到光的吸收和发射两种过程，可比其他光谱方法获得更多的信息。16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes首次记录到荧光现象，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中呈现出了天蓝色。在17世纪，Boyle和Newton等著名科学家再次观察到荧光现象。之后荧光就引起了许多科学家的研究兴趣，荧光分析方法也越来越多的被应用到生物和化学分析当中。
由于激发的荧光强度一定条件下正比于激发源的强度，为了能够获得更强的荧光信号，此后的研究工作在很大程度上是致力于寻找合适的激发光源，其性能指标除了高强度这一最主要的因素之外，还需包括稳定性、长寿命、廉价和操作上的灵活性等特点，而激光光源则满足了上述的性能要求。
激光作为荧光光谱的激发源最初是由美国维恩福纳特、摩姆斯特塔和库尔等人几乎同时开始研究的，随着激光技术的发展，各种类型的激光器相继应用于荧光光谱研究，其中较为常见的是用Ar+激光器、氮分子激光器、Nd:YAG激光器、准分子激光器作为泵浦源，以可调谐染料激光器作为激发源进行荧光研究。与常规激发光源相比，可调谐染料激光器用于荧光光谱研究具有很大的优越性，虽然目前的染料激光器的调谐范围多在可见光波段，但经过倍频可将波长范围扩展到接近真空紫外波段，适用于绝大多数荧光物质的激发波长，同时染料激光器具有很高的激发强度，可以提供高达数十兆瓦的峰值功率。激光束具有很好的空间和时间相干性，在较小的光斑中有很高的功率和很窄的线宽，具有很低的占空因子，有利于提高信噪比，因而可以获得较低的检出限和较高的光谱选择性。
目前激光诱导荧光光谱分析法已经成为一种重要且有效的光谱化学分析手段。在我国，50年代初期仅有少数的分析化学工作者从事激光诱导荧光分析方面的研究工作，但到了70年代后期，该分析法已引起国内分析届的广泛重视，激光诱导荧光光谱法近些年来在生物医学、食品、药物分析、环境分析等领域发挥了重要作用。
让一束激光通过检测区域，调节激光波长，当激光光子的能量（与激光的波长相关）等于检测区域某种组分分子的某两个特定能级之间的能量之差时，该分子会吸收光子能量跃迁至高能态。处于高能态的分子不稳定，在一定时间内它会从高能态返回到基态。在此过程中，分子会通过自发辐射释放能量发光而产生荧光，这就是激光诱导荧光产生的原理。
由荧光的发光原理可知，分子荧光光谱与激发光源的波长无关，只与荧光物质本身的能级结构有关，所以可以根据荧光谱线对荧光物质进行定性分析鉴别。照射光越强，被激发到激发态的分子数越多，因而产生的荧光强度越强，测量时灵敏度越高。一般由激光诱导荧光测量物质的特性比由一般光源诱导荧光所测灵敏度高2-10倍。
在实际应用中，通过激光诱导产生的荧光峰位的分布，可以探测粒子的种类；从荧光的强弱，可得知粒子的浓度以及温度；利用其空间分辨性还可以测量粒子的浓度场、温度场等信息。
激光诱导荧光光谱仪主要由光源、检测池和光纤光谱仪组成。
激光器：激光器是激光诱导荧光光谱仪的重要组成部分，用半导体激光器为光源，采用时间分辨技术可消除瑞利散射光（半径比光或其他电磁辐射的波长）对测定的干扰，同时增加被检测成分之间测定的选择性。激光器具有方向性、单色性好、参数可以精确控制、相干性好、强度大等特性。以上这些特性使激光诱导荧光检测器的信噪比大大增强，显示出较高的灵敏度和较好的选择性。
光纤光谱仪：激光诱导荧光光谱的光学系统元件主要有光学透镜、光栅和电耦合器件（CCD）。透镜在光谱仪中的主要作用是对入射光线的准直以及经过单色后的聚焦。激光在光谱仪中作为光源时，用光栅分光能得到较高的信噪比，但其透光效率低，如f/4光栅大约仅能透过入射光强度的0.3%。由于激光本身有很好的单色性，因此光谱仪中很少采用带通滤光片，采用较多的是剪切式滤光片和空间滤光片。作为荧光信号接收器——电荷耦合器件具有较高的量子效率和信噪比，增强型的甚至可以进行单分子检测。通过加和和合并，电荷耦合器件还可以进一步提高信噪比。
检测池：常规荧光检测池采用立方形的较多。激光垂直入射到检测池上，再从侧面接收其荧光信号，这样可以消除由于激光散射及反射产生的背景噪声，提高检测灵敏度。
由于激光诱导荧光光谱能够提供发射光谱、荧光峰的位置、峰值强度、量子产率、荧光寿命等丰富的荧光信息，使得激光诱导荧光光谱技术已被应用于工业过程检测、药品化妆品分析检测、食品安全、生命科学、刑侦等多个领域，特别是在需要进行无损检测、化学分析、成像分析时，激光诱导荧光分析都能够快速提供重要信息。
在生物学领域激光诱导荧光光谱法可用于叶绿素荧光寿命的测量：采用波长为355nm的激光作为光源激发叶绿素荧光，该方法可以实现对叶绿素荧光寿命的高精度实时监测，证明叶绿素含量与其荧光寿命具有相关性，进一步确定叶绿素含量与荧光寿命的标定曲线。
激光诱导荧光光谱也可用于环保领域中水质的监测，例如激光诱导荧光遥测系统以355nm激发波长的激光器为激发光源。脉冲激光通过卡塞格伦望远镜射入待测水体，散射的荧光进入望远镜，对测得的瑞利散射光以水的拉曼光强度进行归一化，即可得到瑞利散射因子，其与水体浑浊度成线性正相关。
在化学反应过程，例如燃烧系统中，激光诱导荧光光谱分析法可以测量温度、粒子浓度等。激光诱导荧光光谱法在火焰中对粒子浓度的测量包括：瞬态自由基粒子的测量，瞬态自由基是燃烧中的反应中间体，如OH等；还可以测量反应中的污染粒子，用于对污染物的控制与排放，常见的污染粒子有NO、CO、NO2、SO2等分子，激光诱导荧光光谱法的空间与时间的分辨测量有助于深入理解燃烧过程中这些粒子形成的机理，同时还可以用来测量Na、K、NaS等。
维生素B2属于水溶性维生素，是人体中许多重要酶的组成成分，是人体不可或缺的几种维生素之一。维生素B2能够促进发育和细胞再生，促使皮肤、指甲、毛发的正常生长，帮助消除口腔、唇、舌的炎症，增进视力，减轻眼睛疲劳，帮助碳水化合物、脂肪、蛋白质的代谢。维生素B2通常以结合态或游离态存在于粮食、蔬菜、果品及动植物体内。纯品也作为婴幼儿食品、强化食品及饮料的营养添加剂，对于微量维生素B2含量的定量检测是食品药品检验中不可或缺的一环。
近年来对于维生素B2的含量测定研究主要有高效液相色谱法和荧光法。相较于高效液相色谱法，荧光分析法具有取样少，方法快速，选择性强，灵敏度高等特点。目前主要被应用于医学检验、生物医学、药物、环境监测、食品分析等领域，其对体内活性物质及药物代谢物的测定更为重要。维生素B2在蓝光照射下会发生绿色荧光，因此检验食品中维生素B2可先经过预处理，使维生素B2溶于水中，再使用荧光分析法对其定性及定量测定。
1、荧光分析的定量依据：
荧光是物质在吸收光能之后所发生的辐射，样品溶液的荧光强度与样品的吸收系数、量子效率和浓度有关。样品稀溶液的荧光强度F表达式为：F=KΦln(I0/I0-IA)=KΦI0εbc
Φ 其中是荧光物质的量子效率，I0是激发光的强度，IA为荧光物质吸收光的强度，ε是该物质的摩尔吸光系数，b为吸收光程，c为物质浓度，K是与收集效率、传输效率等因素相关的常数。在给定的荧光物质浓度较低的情况下，荧光强度与荧光物质的浓度成正比，这就是荧光检测的定量基础。
2.影响荧光特性的因素：
物质荧光的特性首先取决于其自身的能量状态，即取决于其分子结构，其次还受到外界因素，如温度、溶剂、酸度等的影响。
MS11639光纤光谱仪 | |
激光器 | 405nm稳谱激光器 |
软件 | UspectralPlus软件 |
光纤 | QP600-2-VIS-NIR-SS近红外石英光纤、405nm拉曼激光探头 |
采样附件 | 四通液体测量池、比色皿、固体采样支架 |
MS11639光纤光谱仪：
MS11639是一款光谱范围为200nm-1100nm的光纤光谱仪。检测器采用滨松COMS探测器， 16-bit A/D采样和75%的量子效率为光谱仪提供高信噪比和大的动态范围。 该光谱仪在UV-VIS-NIS具有良好的响应性能。相对常见产品， 采用双闪耀光栅，优化了UV 和NIR波段的光谱响应，且提升了光谱仪灵敏度20%效率，并有效降低了50%的杂散光。配置双闪耀光栅的MS11639光谱仪，有效平衡全谱段响应，可以广泛应用在理化分析、生物样品、半导体材料检测，光学检测和材料检测等领域。
相比于传统CCD探测器，CMOS探测器的应用，在紫外波段具有更好的响应。利用紫外差分吸收光谱技术，非常适合一氧化氮、二氧化硫的检测。MS11639在0-40℃，光谱波长偏移< 0.1nm，具备良好热稳定性，能够应用于定性、定量检测场景。
项目 | 值 |
尺寸 | 126mm×91.5mm×40mm |
重量 | ~420g |
探测器 | Hamamatsu 11639 |
波长范围 | 200-1100nm |
光栅 | 双闪耀光栅 |
消除高阶衍射 | 可选3种前置、4种后置滤光片，以消除光谱中的鬼线 |
光学平台 | M型对称非交叉 C-T式光路 |
狭缝 | 100um |
焦距 | 98mm |
像素 | 2048 pixels |
光学分辨率（FWHM） | <2.6nm |
信噪比 | 400:1 |
动态范围 | 3000:1 |
积分时间 | 4ms-65 second |
连接器 | Micro USB |
运行环境 | Windows XP，Win7，Win8，Win10 |
适配软件 | Uspectral Plus（支持数据自动保存） |
405nm稳谱激光器：
科研版稳光谱激光器主要面向科研用户，需要自行搭建光谱或者光学测量系统用途。该激光器外置了功率调节、功率显示、安全开关， 方便客户使用和观察。内置TEC制冷以及风冷两级制冷， 确保激光器能够实现稳光谱和稳功率。该产品非常适用于拉曼光谱、医疗仪器、传感以及其他测量等领域的应用。
项目 | 值 |
尺寸 | 300x200x62mm |
重量 | 1.2Kg |
输出接口 | FC/SMA905 |
峰值波长 | 405±0.5nm |
激光线宽 | ＜2.0nm |
激光功率 | 0~80mW可调 |
功率稳定性 | ＜3%P-P（2hrs） |
寿命 | 5000hrs |
预热时间 | 15min |
电源电压 | 5V/4A，12V/2A |
工作温度 | 0～45℃ |
工作湿度 | 5～80% |
1.样品制备：
（1）将两片维生素B2药片（维生素B2含量共10mg）研磨粉碎，将其置入100ml容量瓶中并加入去离子水至刻度处，配制出浓度为100mg/L的标准溶液。
（2）取出六个刻度为50ml的容量瓶，分别向其中加入0.5、1、2、3、4、5ml的100mg/L的标准溶液，再加入等离子水至刻度处。从而获得浓度为1、2、4、6、8、10mg/L的标准溶液。
2.仪器连接：
连接仪器如图1所示：405nm激光探头的光源端连接在405nm激光器上，并将探头固定在测量支架上，将四通液体测量池放置于载物台上使得激光恰好能够照射入比色皿中，再用近红外光纤将四通液体测量池与光谱仪相连，并用USB数据线将光谱仪连接到电脑上。
图1.激光诱导荧光实验搭建
3.光谱采集：
（1）将维生素B2溶液样品用移液枪取出置于石英比色皿中，并将比色皿放置于四通液体测量池中。
（2）将405nm激光器探头固定在固体测量支架上，再将四通液体测量池放置于激光探头之下，调节探头高度使得激光焦点位于液面之下。
（3）打开激光器，使得激光从液体正上方射入，光纤从液体测量池侧方接收荧光信号。
（4）打开电脑上的光谱采集分析软件，点击“单次”进行测量得到样品荧光强度随波长变化谱图。
（5）更换样品，重复上述测量步骤。
4. 未知浓度样品的测定：
记录样品荧光光谱波峰处的波长与峰高信息，并绘制在该特定峰位样品的荧光强度-浓度曲线，经线性拟合后得到样品的线性回归方程，通过线性回归方程计算未知样品的浓度。
实验测得六个标准浓度的样品及未知浓度样品的激光诱导荧光光谱如图2所示：
图2. 不同浓度维生素B2荧光光谱
结果显示维生素B2的荧光光谱特征峰位于530nm处，记录530nm处每个样品的特征峰强度表如下：
浓度(mg/L) | 0.05 | 0.1 | 0.2 | 0.3 | 0.4 | 0.5 | 未知浓度 |
特征峰强 | 997.7 | 4342.8 | 11913.3 | 19144.3 | 29141.7 | 35487.6 | 1850.4 |
绘制出在530nm处的荧光强度与浓度的关系图并对其进行线性拟合，得到图2：
图3. 维生素B2发光强度与浓度线性拟合曲线
由图3得知在1-10mg/L浓度范围内，维生素B2荧光强度与其浓度成线性关系，且相关度较高，线性拟合吸收系数为0.9969，线性拟合方程为：y = 78324x - 3395.9。将未知浓度样品在530nm特征峰的强度信息代入方程中可得到其浓度为：0.067mg/L。
通过实验测得了维生素B2在405nm波长的激光器激发下的荧光光谱，通过配制不同浓度梯度的标准溶液得到了维生素B2在一定浓度范围内的发光强度与浓度的关系曲线，通过发光强度与浓度的线性拟合方程计算得出未知样品的维生素B2浓度为0.067mg/L。
